محیط کشت

در آزمایشگاه محیط های کشت بسار متنوعی جهت کشت میکروارگانیسم در دسترس است.

محیط کشت ممکن است تعریف شده باشد؛ یعنی محیطی است که اجزا و ترکیبات شیمیایی آن به طور دقیق شناسایی شده باشد.یا محیط کشت ممکن است پیچیده باشد یعنی ترکیب دقیق شمیایی این محیط ها،از یک بهر تولید تا بهر دیگر،کمی متفاوت است. همچنین محیط کشت ها را نیز می توان به گروهای؛ محیط کشت عمومی؛ که دارای مواد مغذی هستند که برای تمام میکروارگانیسم ها مورد استفاده قرار میگیرند، مثل PDA. محیط کشت انتخابی؛ که به منظور تضعیف رشد میکروارگانیسم های غیر مطلوب و تشویق رشد میکروارگانیسم های مطلوب، طراحی میگردند.محیط کشت تفریقی؛ که برای تشخیص پرگنه های ارگانیسم مورد نظر از دیگر پرگنه هایی که بروی یک ظرف کشت یکسان رشد می کنند، به سادگی امکان پذیر می سازد.  

قارچ ها در محیط کشت مایع رشد بسیار خوبی دارند. اگر هدف ما مطالعه میکرو فلور قارچی مرتبط با یک بیوتوپ (قارچ ها در محیط کشت مایع رشد بسیار خوبی دارند). اگر هدف ما مطالعه میکرو فلور قارچی مرتبط با یک بیوتوپ ( (biotope خاصی می باشد، حتما باید محیط کشت جامد تهیه نموده و بکار ببریم تا کلونی های متماییز و جدا از هم به دست آوریم. به علاوه، دقت زیادی به عمل آورد تا کلونیهای مشاهده شده که رشد بسیار سریع روی سوبسترا دارند با یکدیگر ممزوج نشوند زیرا در این صورت مطالعه  و مشاهده و نیز جدا سازی آنها امری غیر ممکن خواهد بود. پس یک محیط کشت افتراقی نباید خیلی غنی باشد. گاهی این محیط کشت حاوی مواد بازدارنده رشد (سورفکتانت ها) یا حتی می تواند دارای موادی بسیار فقیر از نظر غدایی (مثل آب آگار) باشد.

برای اینکه امکان رشد قارچ ها فراهم گردد، یک محیط باید دارای منبع نیتروژن و کربن باشد و نیز دارای نمک های معدنی متفاوتی می باشد. این عناصر غذایی منحصرا می توانند از بعضی قسمتهای گیاهان یا عصاره گیاهان (محیط کشت طبیعی حاوی آرد، با ماده اصلی broth  یا نکتار) تامین شوند، یا از ترکیبات شیمیایی (محیط کشت سنتتیک مثل محیط Czapek ) و یا تلفیقی از دو نوع (محیط کشتهای نیمه سنتتیک) باشد. این محیط کشت های پایه برای جدا سازی قارچ ها بسیار نامناسب هستند زیرا باکتری ها نیز میتوانند در آنها رشد کنند.پس این محیط باید طوری تعبیه شود که بازدارنده رشد باکتری ها باشد واز رشد قارچ ها ممانعت به عمل نیاورد. این امر می تواند با تغییر PH یا با افزودن عوامل ضد باکتریایی صورت گیرد. حال محیط کشتی که درست می شود برای جدا سازی میکروفلور قارچی به صورت کلی مناسب است، برای اینکه یک نوع قارچ را از دیگر قارچ ها جدا سازی نماییم، لازم است تا یک محیط کشت انتخابی تهیه شود تا با تامین مواد مغذی لازم برای رشد این گونه های خاص و مورد نظر که برای دیگر گونه ها نامطلوب است می توان این مشکل را بر طرف نمود. چنین فرایندی مستلزم داشتن دانش فراوان از نیاز های غذای ارگانیسم های مورد مطالعه می باشد که امری دشوار است. پس از آن عموما تصمیم دیگری اتخاذ می گردد،که این تصمیم استفاده از طیف وسیعی از بازدارنده ها می باشد که در حضورشان تنها قارچ مورد نظر ما می تواند رشد کند.

در یک خاک قارچ ها عموما در معرض اثرات بازدارنده  از رشد هستند و رشد فعالی ندارند. گاهی به فرم میسلیومی در لابلای بقایای گیاهی پناه می گیرند؛ آنها در اکثر مواقع به فرم اندام های حفاظتی می باشند، بنابراین بسیار مهم است تا اطمینان یابیم یک محیط کشت افتراقی که برای رشد میسلیوم مناسب است برای رویش (germination) وتبدیل این فرم های غیر فعال و استراحت کننده نیز مساعد باشد. مسلما این امر همیشه صورت نمی گیرد: مثلا پلی میکسین بازدارنده رشد میسلیومی Phytophthora cinnamomiنبوده؛ از طرف دیگر از ایجاد فرم رویشی کلامیدوسپورهای آن نیز جلوگیری بعمل می آورد.

عناصر پایه

کربن؛ این منبع همواره توسط یک گلوسید تامین می شود که می تواند به راحتی هیدرولیز گردد. مثلا گلوکز،ساکاروز،عصاره مالت یا نشاسته در محیط کشت با پایه سیب زمینی یا غلات دارای این ویژگی ها می باشند.البته هنوز انتخاب منبع کربنی که در عملکرد یک قارچ خاص که مورد نظر می باشد متداول نیست. ولی با این حال، به نظر می رسد امکان اینکه محیط کشت انتخابی تر شود وجود دارد.    

نیتروژن؛ می تواند به فرم معدنی یا آلی تامین شود. اکثر قارچ ها عموما توانای اسیمیله کردن نیتروژن آمونیاکی را به خوبی نیتروژن نیتریتی دارند .در حالیکه موکورالها در حضور یونهای نیترات به خوبی رشد نمی کنند بنابراین کاربرد نیتروژن نیتریتی در محیط کشت افتراقی از تزاید این عوامل مهاجم نامطلوب جلوگیری می کنند. هنگامی که نیتروژن آلی بکار می رود اغلب به فرم پپتون تامین می گردد.

عناصر معدنی؛ علاوه بر کربن و نیتروژن دیگر عناصر معدنی اصلی و مهم نظیر فسفر، پتاسیم، منیزیم و گوگرد می باشند که به اشکال PO-33 ,k+ ,Mg2+ ,so42-  تامین می گردند. فلزاتی که اجزای سازنده آنزیم ها را تشکیل می دهند مانند مس، مولبیدن، آهن،روی عموما به شکل نا خالصی در داخل آگار و اجزا و ترکیبات اصلی وجود دارند.

 

محیط کشت PDA 

یک محیط کشت عمومی برای رشد بیشتر قارچ هاست و اکثر قارچ ها می توانند بروی آن رشد کنند.

 مراحل ساخت محیط کشت PDA

مواد لازم برای ساخت یک لیتر محیط کشت: سیب زمینی 300 گرم،آگار 16 گرم،دکستروز 20 گرم

مراحل کار

300 گرم سیب زمینی خرد شده را با آب مقطر  آب پز کردیم  و بعد با استفاده از پارچه صافی  عصاره آن را گرفته  و با استفاده از استوانه مدرج اندازه آن را به  یک لیتر رساندیم و آن را در دو ارلن 1000 سی سی ریختیم  و به هرکدام از ارلن ها مقدار 8 گرم آگار و 10 گرم دکستروز را اضافه کردیم .

درب هرکدام را مقداری  پنبه فشرده  گذاشتیم به شکلی که اگر پنبه را با دست بکشیم ارلن هم همراه آن بلند شود .ارلن ها را داخل اتو کلاو قرار دادیم تا ضد عفونی شود.

بعد از خروج از اتوکلاو  آن را با استفاده از آب شیر سرد کردیم البته تا حدی که محیط داخل ارلن جامد نشود(حرارت آن صورت را نسوزاند)، وسپس آن را به زیر هود برده(هود باید از قبل ضد عفونی شده باشد و اشعه UV  آن به مدت 20 دقیقه روشن شده باشد) و پنبه را برداشتیم و30 قطره اسید لاکتیک 50 درصد را به هر کدام از ارلن  افزودیم و به آرامی در داخل پتری دیش ها ریختیم.

 

محیط کشت CMA

یک محیط کشت نسبتا ضعیف است،که برای قارچ های فیتوفتورا و پیتیوم مورد استفاده قرار می گیرد.

مواد مورد نیازبرای یک لیتر محیط کشت:عصاره 40 گرم بلغور ذرت خرد شده، آگار 16 گرم

مراحل کار

 ابتدا ذرت را با دستگاه خرد می کنیم، 40 گرم آن را وزن می کنیم و سپس دانه های ذرت را در پارچه صافی قرار دادیم(البته ذرت پاپ کورن خرد شده در بخش موجود بود) و پارچه را داخل ظرف آب گذاردیم تا بجوشد.

در مرحله بعد پارچه صافی را جدا کرده و عصاره را با آب مقطر حجمش را به یک لیتر می رسانیم و آگار را نیز به آن می افزایم، و آن را در دو ارلن 1000سی سی ریخته و درب آنها را با پنبه محکم می بندیم و در اتو کلاو گذاشته تا استریل شود.

بعد از پایان اتو کلاو آن را در محیط بیرون گذاشتیم تا سرد شود، سپس در زیر هود محیط را در داخل پتری دیش ریختیم.

 

محیط کشت PARP

 یک محیط اختصاصی برای پیتیوم و فیتوفترا است، که دارای یکسری آنتی بیوتیک ها و قارچ کش هاست. محیط پایه آن CMA  است که یکسری مواد را به آن اضافه می کنیم.

مواد لازم: محیط کشت CMA

/ 5 نظر / 505 بازدید
مریم

با سلام امیوارم حالتون خوب باشه ممنون از توضیحات خوبتون.خیلی استفاده کردم.کلا مطلب در مورد قارچ های میکروسکوژی و محیط کشت اونها خیلی کمه.بازم ممنون

شهناز

مرسی خیلی مفید بود

خیلی پاچه خواری حالم به هم خورد اه اه با اون تقدیمت

***

عالى

کمال صادقی خمارتاجی

سلام بسیار بسیار ممنون از لطفتون. پیجتون فوق العاده س در زمینه باکتری شناسی گیاهی خصوصن خیلی به بنده کمک کرد تو آزمایشگاه. حالا هم مدتهاست سرچ میکنم که محیط کشت فایتوفتورا رو ساده تر پیدا کنم که اینجا تونستم. امابسیار عالی تر میشه اگر رفرنس هم بدید به مطالبتون و اون مقالاتی که زحمت برگردانشون رو کشیدید و واقعن کار زمان بر و پر زحمتیم هست. لطفن در این خصوص برای فایتوفتورا اگر امکانش هست برای بنده منبع این پست رو ارسال بفرمایید. از لطفو همکاریتون سپاسگزارم