Double antibody sandwich ELI SA

ساندویچ دوطرفه ی الایزا

بر اساس روش کلارک و آدامز 1977 که به شرح زیر انجام می گیرد.


آماده سازی نمونه ها به منظور انجام آزمون الایزا در هر دو مورد DAS , TAS بدین صورت خواهد بود:

از بافت های آلوده (در حد امکان بخش های دارای علائم) و سالم گیاهی به نسبت 1:5 توسط بافر عصاره گیری (Extraction buffer) داخل هاون چینی استریل عصاره گیری انجام می شود. این عصاره ها در اپندورف های استریل جمع آوری و نگهداری می شود. 

در روش DAS-ELISA

1. جهت پوشش دادن چاهک ها با IgG ابتدا آن را در داخل ظروف کوچک استریل بر اساس میزان توصیه شده توسط مراکز تولید کننده ی آنتی سرم به کمک بافر پوششی coating bufferرقیق نموده، به میزان 100 میکرولیتر از این محلول در هر یک از چاهک های پلیت الایزا ریخته می شود. پلیت با کمک پارافیلم یا کیسه ای نایلونی پوشانده شده و در انکوباتور 37 به مدت 4-2 ساعت قرار می گیرد.

2. شستشوی پلیت به کمک بافر شستشوWashing buffer سه بار و هر بار 3 دقیقه

3. به میزان 100 میکرولیتر از عصاره ی هر نمونه در دو تکرار ریخته شده، به علاوه 4 چاهک با عصاره ی نمونه سالم به عنوان شاهد منفی و تعداد 2 چاهک با عصاره ی آلوده به عنوان شاهد مثبت و دو چاهک نیز به عنوان بلانک با بافر عصاره گیری پر خواهد شد. مجددا پلیت را پوشانده به مدت یک شب در سردخانه قرار دهید.

4. مرحله ی ریختن آنتی بادی متصل به آنزیم IgG-Conjugate

پس از یک شب، شتستشوی پلیت همانند روش 3 انجام گرفته و پس از خشک نمودن پلیت، همه ی چاهک ها با IgG-Con رقیق شده در بافر کانجوگیت بر اساس توصیه ی مرکز تولید کننده پر می شود. پلیت به مدت 4-2 ساعت در انکوباتور 37 درجه قرار داده می شود.

5. ریختن سوبسترا

مجددا پلیت همانند روش های ذکر شده شسته شده و سپس محلول سوبسترا در چاهک ها ریخته شود. میزان 10 میلی لیتر از این محلول را (به منظور پوشاندن یک پلیت کامل با 96 چاهک)،در داخل ظرفی استریل ریخته و به میزان یک میلی گرم در میلی لیتر پارانیتروفنیل فسفات در آن حل نموده و بلافاصله در هر چاهک 100 میکرولیتر از محلول را ریخته و به منظور جلوگیری از تاثیر نور بر روی سوبسترا پلیت باید در محل تاریکی قرار داده شود.

6. پس از مدت زمانی با توجه به غلظت ویروس در نمونه های مورد نظر، نتیجه به صورت تغییر رنگ (زرد) قابل مشاهده خواهد بود.

7. عمل خواندن جذب، به کمک دستگاه ELISA-reader صورت می گیرد.