بدین منظور جدایه ها بر روی محیط کشت نوترینت آگار جامد و بدون قند به صورت مخطط کشت شدند. در این بررسی از کشت جوان (24 ساعته) استفاده شد، زیرا در صورت بالا رفتن سن کلنی جدایه ها قند زیادی تولید می شد.


     قسمت کوچکی از محیط کشت در کنار پتری برداشته شد و سپس کلنی های جوان باکتریایی موجود بر روی محیط کشت
نوترینت آگار بوسیله آب مقطرسترون و با فشار به آرامی سوسپانسیون شده و در آن قسمت
تجمع یافتند. مقدار 2 میلی لیتر از سوسپانسیون به درون تیوب های اپندورف 2 میلی
لیتری منتقل شد. تیوب ها در 13000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس
محلول رویی را دور ریخته و مقدار 1 میلی لیتر آب مقطر سترون به تیوب ها اضافه شد.
تیوب ها کمی ورتکس شده و مجدداً در 13000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ
شدند. این عمل جهت کاهش پلی ساکاریدهای باکتری

2 الی3 مرتبه تکرار شد. مقدار 300 میکرولیتر از محلول تریس 1/0 مولار به تیوب ها
اضافه و کمی ورتکس شدند. سپس 300 میکرولیتر محلول Lysis solution محتوی SDS یک درصد و NaOH 2/0 نرمال به تیوب ها اضافه گردید.
سپس مقدار 700 میکرولیتر از محلول کلروفرم- ایزوآمیل الکل (1:24) به محتویات تیوب
ها اضافه شد. تیوب ها را برای 5 دقیقه به آرامی تکان داده به طوری که محتویات تیوب
ها به طور کامل با هم مخلوط شدند. سپس تیوب ها با سرعت13000 دور در دقیقه به مدت
10 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول رویی با دقت کامل برداشته شده و به درون تیوب های
5/1 میلی لیتری سترون منتقل شدند. جهت رسوب دادن  DNA، هم حجم محلول رویی به آن
ایزوپروپانول سرد با دمای


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 





20-
اضافه گردید. الکل و محلول رویی با تکان دادن آرام تیوب ها به مدت 1 الی2 دقیقه
کاملاً مخلوط شده و برای نیم ساعت در

20-
نگهداری شدند. جهت سهولت در کشیدن کلاف  DNA، نوک یک سرسمپلر 100 میکرولیتری را
کمی بریده تا گشاد شده و به آرامی کلاف به تیوب 5/0 میلی لیتری منتقل و در 13000
دور در دقیقه

به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد. پس از شستشوی تیوب ها با اتانول 70% ، آن ها را به
صورت وارونه روی دستمال کاغذی گذاشته تا کاملاً خشک شدند. در مرحله آخر مقدار 100
میکرولیتر آب مقطر سترون به تیوب های محتوی رسوب DNA اضافه کرده و تا هنگام استفاده در

20-
نگهداری شدند.

از این DNA به عنوان رشته الگو در آزمون PCR  استفاده شد (Gomes et
al
., 2000