هیبریداسیون در محل(In Situ Hybridization(ISH) ) همانطور که از نام آن برمی آید روشی برای
تعیین موقعیت و ردیابی ترادفهای خاص mRNA و DNA در مقاطع بافت های فیکس شده و یا در آموده
های سلولی از طریق هیبرید کردن رشته مکمل یک نوکلئوتید نشانگر(پروب) به ترادف مورد
نظر است. در این روش که Histochemistry
Hybridization نیز نامیده می شود.


DNA یا RNA با ترادفهای مکمل خود پیوند هیدروژنی برقرار
می کنند. درهیبریداسیون معمول بایستی RNA یا DNA
را جداسازی کرده و درروی ژل تفکیک نمود و سپس بر روی غشای نیتروسلولز لکه گذاری شده
و با ترادف مکمل آن پروب کردن صورت میگیرد(10٬6٬2٬3).
مفاهیم اساسی این روش(ISH) مشابه
روشهای معمول هیبریداسیون است ولی در این روش از پروبی استفاده می شود که ترادفهای
خاص نوکلئوتیدی را در داخل سلولها و بافتها ردیابی می کند. همچنین ویژگی های
مورفولوژیکی بافت حفظ میشود(1). حساسیت این روش به میزانی است که بتواند  20- 10کپیmRNA
 را
در هر سلول تشخیص دهد.

امروزه از روش
ISH در محدوده ی  وسیعی از تحقیقات مخصوصا در زمینه بیولوژی رشد و
همینطور در اهداف تشخیصی در آسیب شناسی استفاده می شود(4) . در این روش با یکسری
مشکلات مواجه می شویم که در هیبریداسیون معمول وجود ندارند. ممکن است ترادف مورد
نظر در بافت یا سلول غلظت پایینی داشته باشد، در اثر ارتباط با پروتئین مخفی شده
باشد و یا درون سلول و یا ساختمان سلولی محافظت شده باشد. بنابراین در پروب کردن
بافتها و یا سلولهای مورد نظر بایستی نفوذپذیری و امکان مشاهده هیبرید شدن ترادف
نوکلئوتیدی به پروب مورد نظر بدون تخریب اجزای ساختمانی سلول یا بافت افزایش داده
شود(10٬6).

به منظور بدست آوردن بالاترین  سطح وضوح و تفکیک سیگنال ها بایستی به نوع پروب
مورد استفاده و بهترین روش نشاندار کردن آن نیز توجه داشت. انتخاب گزینه ها به نوع
تحقیق، امکانات موجود و نحوه ارزیابی فرد آزمایش کننده از نتیجه کار (کمی یا کیفی)
بستگی دارد(10٬6).

مواد و روشها

1-   
انتخاب پروب

پروب ها ترادف های مکمل برای بازهای
نوکلئوتیدهای ترادفهای خاصی از RNA  یا DNA هستند.
اندازه آنها از 40-20 و تا 1000 جفت باز
متغیر است.  در اینجا نیز هدف تحقیق و نوع
ترادفی که باید ردیابی شود در انتخاب اندازه پروب موثرند. قدرت اتصال باندهای RNA-RNA در مقایسه
با DNA-RNA
بیشتر است. این پایداری از شرایط مختلف هیبریداسیون از قبیل غلظت فرمآمید٬ غلظت
نمک٬ دمای هیبریداسیون و pH متاثر می شود.
بهینه سازی این فاکتورها نیاز به زمان زیادی دارد (10٬6).

 

2-1: انواع پروبها

1-2-1: پروب های الیگونوکلئوتیدی

اینها بطور مصنوعی توسط دستگاههای
اتوماتیک سنتز DNA ساخته می شوند. این پروب ها به آسانی در
دسترس بوده و استفاده ازآنها مقرون به صرفه است. فقط نیازاست که ترادف نوکلئوتیدی
مورد نظر را بدانیم و با استفاده ازتکنیک های بیوانفورماتیک و نرم افزارهای طراحی
پروب، می توان پروب های اختصاصی ژن را طراحی کرد. به دلیل اندازه ی کوچک (50- 40
جفت باز) در برابر RNase  مقاوم بوده و به آسانی وارد بافت میشوند و چون
بطور مصنوعی ساخته میشوند میتوان چندین پروب با محتوی GC
یکسان طراحی کرد و همه اینها را در یک پروتکل هیبریداسیون با هم بکار برد. از طرف
دیگر چون تک رشته ای هستند نیاز به واسرشته کردن آن قبل از هیبریداسیون وجود ندارد(2٬10٬6).

2-2-1: پروب های ssDNA

مزایای این پروبها مشابه پروب های
الیگونوکلئوتیدی است ولی اینها اندازه بزرگتری( 500- 200 جفت باز) دارند. تهیه ی  این پرایمرها نیاز به زمان و هزینه زیاد و مجموعه
ای از مهارتهای ملکولی دارد. پروبهای ssDNA  با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز
نامتقارن (Asymmetric PCR) تولید می شوند.
پس از تکثیر ترادف مورد نظر٬ در PCR  بعدی فقط از پرایمر معکوس استفاده میشود تا یک
رشته DNA تولید شود(2٬3٬10٬6).

3-2-1: پروب های dsDNA

اگر ترادف مورد نظر معلوم باشد میتوان
آن را بطور سریعی توسط PCR تکثیر کرد.
در غیر اینصورت بایستی آنرا در داخل یک باکتری همسانه سازی کنیم. در روش دوم مقدار
زیادی از ترادف مورد نظر بدست می آید.  ساختن
این پروبها نسبتا آسان است و حساسیت نشاندار کردن پروب های dsDNA را میتوان
با هیبرید کردن متقاطع(cross
hybridization) رشته اولیه هیبرید شونده با
رشته ی مکمل نشاندار شده، به میزان زیادی افزایش داد که در اصطلاح به این عمل networking
گفته می شود. اشکال عمده ی این پروبها: نیاز به واسرشته کردن قبل از هیبریداسیون و
رقابت دو رشته پروب با ترادفهای هدف برای هیبرید شدن می باشد که حساسیت کار را
کاهش می دهند(1٬2٬3٬10٬6).

 

4-2-1: پروب های RNA(ریبوپروبها
یا پروبهای
cRNA)

این پروب ها مشابه پروب های قبلی هستند
با این تفاوت که هیبریدهای RNA-RNA پایداری
خوبی داشته و در برابر RNase مقاومند.
بنابراین می توان پس از هیبریداسیون نمونه ها را با RNase
 تیمار کرد تا RNA
های هیبرید نشده حذف شوند و احتمال تشکیل پس زمینه کاهش یابد. پروبهای RNA
حساس به RNase هستند و تمامی ابزارهای مورد
نیاز بایستی با DEPC یک دهم درصد
تیمار شوند و ظروف شیشه ای را باید اتوکلاو نمود. با وجود این مشکلات این پروبها
هنوز هم بیشترین استفاده را در روش ISH دارند(10٬6).
این پروبها به دو روش تهیه می شوند:

- بدست آوردن RNA
های مکمل با استفاده از نسخه برداری توسط RNA polymerase
از روی mRNA در جهت 3 به
5 .

- نسخه برداری آزمایشگاهی DNA
پلاسمید خطی شده از باکتریوفاژهای T3٬T7
یا SP6 با استفاده از نسخه برداری توسط RNA
polymerase. 
اگر دو پروموتور نسخه برداری فاژ در سمت polylinker
site ناقل در جهت مخالف هم قرار گیرند می توان
بطور انتخابی پروب های مثبت(sense) و منفی(antisense)
تولید نمود(2٬3٬10٬6).

با مقایسه ی انواع پروب ها می توان
دریافت که پروبهای الیگونوکلئوتیدی نسبت به دیگر انواع پروب ها مزیت دارند و با
استفاده از این پروب ها می توان ISH را به روشی
سریعتر٬ ساده تر٬
ارزانتر٬ تکرارپذیر و با اختصاصیت بالا تبدیل
کرد(10٬6).

3-1: روش های نشاندار کردن پروب ها

از روش های آنزیمی مانند:  Nick translation٬ Random primer labeling٬ End tailing  End labeling٬
و T4 DNA polymerase میتوان برای نشاندار کردن DNA استفاده نمود. اگر شرایط واکنش بطور بهینه کنترل شود پروبهای نشاندار شده
در روش Nick translation بالاترین
حساسیت را تولید می کنند. علاوه بر روش های آنزیمی می توان از نشاندار کردن مستقیم
شیمیایی برای DNA و RNA
استفاده کرد. این روش ها ساده تر هستند ولی روش های آنزیمی رضایت بیشتری تولید
میکنند(10٬6٬1٬2٬3).

4-1: ترکیبات مورد استفاده در نشاندار
کردن پروبها

1-4-1: نشان های رادیو اکتیو: هنوز
هم در بسیاری از آزمایشگاه ها از پروب های رادیواکتیو مانند 32P,
35S, 14C, 3H استفاده
میشود. در روش ISH  استفاده از 35S
به دلیل فعالیت بالای آن، که برای تشخیص رونوشت های موجود در غلظت های پایین ضروری
است خیلی متداول می باشد. در استفاده از رادیواکتیو بایستی در معرض قرار گرفتن
ضایعات و میزان آلودگی مدنظر قرار گیرد. عمر مفید نگهداری پروب نشاندار شده ذاتا
به نیمه عمر رادیواکتیو بکار رفته بستگی دارد. نیمه عمر 35S
80 روز است. استفاده از پروب های نشاندار شده با 35S
خیلی سریع و راحت بوده و حساسیت بالایی دارند. ولی مشکلات استفاده و نگهداری مواد
خطرناک رادیو اکتیو و همچنین مدت زمان طولانی انکوباسیون باعث افزایش گرایش به
استفاده از مواد غیر رادیواکتیو شده است(2٬3٬10٬6).

2-4-1: نشان های غیر رادیو اکتیو: چندین
نشان غیر رادیواکتیو مانند بیوتین٬ digoxin
digoxigenin(DIG) ٬٬ دی نیتروفنیل٬ جیوه٬ استیل
آمینو فلورن٬ سولفون و برچسب های فلوروسنت از جمله
فلوروسین(FITC)٬ Texas
Red و rhodmania
نیز بطور موفقیت آمیزی در ISH مورد
استفاده قرار گرفته اند. این
برچسب ها تجزیه ی ذاتی ندارند و پس از نشاندار کردن پروب میتوان آن را بلافاصله
استفاده کرد یا اینکه می توان آن را به حجم های کوچکی تقسیم کرده و بصورت lyophilized
در دمای 20 درجه سانتی گراد زیر صفر بمدت 2-1 سال نگهداری نمود(2٬3٬10٬6٬5). از
پروبهای نشاندار شده با digoxigenin  در مطالعه نحوه ی انتقال با بذر در ویروس موزائیک بذرزاد نخود(PSbMV) وردیابی
ویروئید  avocado
sunblotch در کلروپلاست استفاده شده است.

( 14٬13).

2- روشهای مورد استفاده در ISH

1-
2: RISH
(
RNA In Situ Hybridization):

RNA در انتقال
اطلاعات ژنتیکی از DNA ژنومی به
پروتئین ها در طی بیان ژن نقش اساسی دارد. از این روش میتوان برای ردیابی ترادفهای
RNA و مطالعه توزیع سلولی RNA
در ارتباط با فرآیندهای رشدی٬ فیزیولوژیکی٬
پاتولوژیکی و سم شناسی استفاده کرد. میزان RNA
معمولا از DNA همولوگ آن بیشتر است و راحت تر تشخیص داده
می شود ولی RNA در معرض تخریب ناشی از RNase
قرار دارد.

2-
2:
DISH
(DNA
In Situ Hybridization
)

از این روش در شناسایی ژن های ویروسهای
انسانی و گیاهی در داخل بافت یا سلول و مطالعه کروموزوم ها در مراحل مختلف استفاده
شده است.

 

 

3-
2: FISH
(
Fluorescent  In Situ Hybridization)

روشی سریع٬ امن
و با وضوح بالا برای تشخیص همزمان چندین هدف در داخل بافت است (multicolor
FISH). با پیشرفت های اخیر در تصویربرداری٬ بدست
آوردن داده ها و آنالیز آنها بصورت اتوماتیک صورت می گیرد. از این روش بیشتر در
مطالعه ی الگوهای بیان ژن در جنین و گیاهان٬ سیتولوژی٬ مطالعه
ناهنجاری های کروموزومی٬ بررسی اثرات درمانی و ...
استفاده می شود (3٬2٬7٬9٬11).

4-
2:
ISH with Nanogold-Streptavidin
: نوکلیئک اسید
با بیوتین نشاندار میشود و با استرپتاویدین متصل به ذرات طلا یا نقره می توان آن
را شناسایی کرد. این روش حساسیت بالایی داشته و مشاهده ی سیگنال ها نیازی به
امکانات پیشرفته ندارد و با میکروسکوپ زمینه روشن براحتی قابل مشاهده است. از این
روش در الکترون میکروسکوپی نیز می توان استفاده کرد(3٬8).

3- تهیه مواد

در
فیکس کردن بافت برای استفاده در روش ISH  برای ردیابی mRNA
بایستی توجه داشته باشیم که mRNA بطور معمول
به میزان زیادی سنتز و تخریب می شود. همچنین میزان mRNA
در محیط زنده(in vivo) در اثر
وارد کردن استرس به جانوران به میزان زیادی تغییر می کند. پس در حیواناتی که می
خواهیم در آنها mRNA تشخیص دهیم
بایستی با حداقل استرس وارده ذبح کرده و بافت را به سرعت فیکس گردد و اقدامات بعدی
به منظور اجتناب از آلودگی به RNase در پوست و
تجهیزات آزمایشگاهی صورت گیرد. برای فیکس کردن بافتها از روشهایی استفاده میشود که
باعث دسترسی پروب به ترادف مورد نظر شوند٬
حداکثر میزان RNA یا DNA
سلولی را حفظ کنند و در نهایت باعث حفظ جزئیات مرفولوژیکی در بافت شوند (2٬3٬10٬6٬1).
بطورمعمول از این روشها در ISH استفاده
میشود:

1-3:
مقطع گیری از بافت های گیاهی و حیوانی یخ زده(Cryosectioning)
و فیکس کردن آنها در پارافرمالدئید

2-3:
مقطع گیری از بافتهای جاسازی شده در پارافین و فیکس کردن آنها با فرمالین(4)

3-3:
استفاده از سوسپانسیون سلولها بر روی اسلاید و فیکس کردن آنها با متانول

4-3:
پخش کردن کروموزومها گیاهی و حیوانی بر روی اسلاید و فیکس کردن آنها با مخلوط
اتانول واسید استیک

در
استفاده از فیکساتیوهای رسوب دهنده مانند مخلوط اتانول واسید استیک نفوذ پروب
بخوبی صورت می­گیرد ولی امکان از دست دادن RNA
یا  DNAنیز وجود
دارد. گلوتارالدئید مقدارRNA  و نیز مرفولوژی بافت را حفظ می کند ولی به دلیل
اتصال به پروتئین ها(cross-linking) باعث کاهش
نفوذ پروب می شود. در استفاده از فیکساتیوهای پارافین و فرمالین بدلیل افزایش
اتصال به پروتئین ها و از دست رفتن RNA  یا DNA
در طی جایگذاری حساسیت کاهش می یابد. موفق ترین فیکساتیو پارافرمالدئید 4 درصد است
که حساسیت خوبی دارد. در این روش هرچند مقدار کمی مرفولوژی بافت آسیب می بیند ولی
باز می توان از آن در ISH استفاده کرد(10٬6٬2٬3).

4- انجام
آزمایش هیبریداسیون

برای انجام
هیبریداسیون پروب بایستی به ترادف هدف دسترسی پیدا کند. در مقاطع بافت مشکل نفوذ
مواد وجود ندارد ولی در سوسپانسیون سلول یا کل موجود زنده موانعی از قبیل غشای سلولی
وجود دارد. بنابراین تیمارهایی باید روی آنها صورت گیرد.

1-4: نفوذپذیر کردن (Permeablization):
معمولا از یکی از موا د زیر برای نفوذپذیر کردن استفاده میشود. تیمار
با HCL 0.2M  بمدت نیم ساعت تصور می شود که با خارج ساختن پروتئین ها و هیدرولیز ترادف
هدف به کاهش پس زمینه در رنگ آمیزی کمک می کند. تیمار با شوینده هایی از قبیل SDS
یا X-100 Triton
برای نفوذپذیرکردن غشا از طریق خارج کردن لیپیدها استفاده می شود. اگر بافت را در
موم جاسازی کنیم نیازی به این تیمار نیست. در نهایت از پروتئیناز K
برای حذف پروتئین هایی که ترادف هدف را احاطه کرده اند استفاده می شود. غلظت و
زمان انکوباسیون بهینه ی آن بایستی محاسبه شود تا از هضم بیش از حد و در نهایت
تخریب بخش عمده بافت یا اجزای سلولی جلوگیری شود(10٬6٬2).

 

2-4: مراحل قبل از هیبریداسیون

این مراحل بمنظور کاهش پس زمینه در رنگ
آمیزی بکار می روند. در استفاده از آنزیم های آلکالین فسفاتاز و پراکسیدازها
بایستی از خنثی شدن فعالیت آنزیمی مطمئن شویم. پس مانده فعالیت این آنزیمها منجر
به نولید پس زمینه زیادی میشود. در مورد پراکسیدازها بافت را بمدت نیم ساعت در
محلول یک درصد H2O2 در متانول
استفاده میشود. با افزودن ماده "لوامیزول" به محلول زمینه میتوان از
فعالیت آلکالین فسفاتاز جلوگیری کرد. هرچند بنظر می رسد این کار ضروری نباشد چون
فعالیت آلکالین فسفاتاز در طی هیبریداسیون از بین می رود.

در صورت استفاده از پروب های RNA
بایستی با استفاده از استیک انهیدرید 0.25% در تری اتانول آمین استیلاسیون صورت گیرد. اینکار
علاوه بر غیرفعال کردن RNase باعث کاهش
پس زمینه نیز می شود. مرحله پیش از هیبریداسیون شامل انکوباسیون بافت یا مقطع در
محلولی حاوی همه ی عناصر محلول هیبریداسیون بجز پروب است (10٬6٬2٬3).

3-4: هیبریداسیون

هیبریداسیون موفق، به توانایی پروب در
اتصال به رشته ی  مکمل خود در دمای پایین
تر از نقطه ذوب آن(Tm) بستگی  دارد. عواملی نظیر دمای هیبریداسیون٬ pH٬ غلظت کاتیون های یک ظرفیتی و حضور حلال های آلی در
هیبرید شدن پروب به ترادف هدف تاثیر دارند. دما و pH
بالا٬ غلظت یونی پایین و غلظت بالای فرمامید
منجر به کاهش اتصال پروب به ترادف هدف می شود. هیبریداسیون با قرار دادن مقدار کمی
از محلول هیبریداسیون بر روی cover slip
و سپس قرار دادن آن بر روی مقاطع بافت صورت می گیرد. همه ی حباب ها بایستی از زیر cover
slip خارج شوند تا نفوذ پروب به خوبی صورت گیرد. در
ذیل یک محلول تیپیک هیبریداسیون با دمای هیبریداسیون 37 درجه سانتیگراد و مدت زمان
انکوباسیون به مدت یک شب(O/N) آورده شده
است.

دکستران سولفات: این
ماده بشدت هیدراته شده و با استفاده از آن می توان حجم آب مورد استفاده برای
هیدراته کردن نوکلئوتیدها کاهش داد و باعث بالارفتن غلظت پروب در محلول و در نتیجه
افزایش میزان هیریداسیون میشود.

فرمامید و DTT:
اینها حلال های آلی هستند که پایداری دمایی باندها را کاهش داده و
امکان انجام هیبریداسیون در دمای پایین تر را ممکن می سازند.

SSC: کاتیونهای
یک ظرفیتی را فراهم میکند که با گروههای فسفات اسیدنوکلئیک واکنش داده و همکنش
الکترواستاتیک بین دو رشته را کاهش میدهند.

: EDTA کاتیونهای
دو ظرفیتی آزاد را که باعث پایداری دوبلکس DNA
میشوند از محلول هیبریداسیون حذف می کند.

از مواد دیگری مانند poly
A٬ محلول دنهاردت٬ tRNA
و کنترل ها نیز در محلول استفاده می شود تا شانس اتصال غیر اختصاصی پروب را کاهش
دهند(10٬6).

4-4: شستشو: پس از
هیبریداسیون به منظور حذف پروبهای باند نشده و پروبهایی که با اتصال سست و ناقصی
به ترادفها چسبیده اند، شستشو در شرایط  stringencyبالا
صورت میگیرد و پس زمینه را کاهش می دهد (2٬3٬10٬6).

5-4: ردیابی و مشاهده ی سیگنال ها

پروب های رادیواکتیو  و فلوروسنت را می توان بطور مستقیم ردیابی کرد.
پروبهای رادیواکتیو با در معرض قرار دادن مقطع بافت یا سلولها در مقابل فیلم عکاسی
و پس از ظاهر کردن فیلم قابل مشاهده هستند. بجای فیلم عکاسی برای ردیابی پروبها در
داخل مقطع بافت٬ میتوان اسلاید حاوی مقطع بافت را در
داخل امولسیون عکاسی فروبرده و سپس خشک کرد. اسلاید را در دمای 80 درجه سانتیگراد
زیر صفر قرار می دهند و پس از دوره ی انکوباسیون اسلایدها را همانند فیلم عکاسی
ظاهر می کنند. دانه های سیاه نقره ای نشان دهنده ی محل رونوشت های نشاندار شده
است. این روش در بررسی بیان ژن در سطح سلول به سلول بکار می رود. پروبهای فلوروسنت
را می توان با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت یا دستگاه plate
reader ردیابی کرد(2٬3٬10٬6).

برخلاف دو نوع پروب قبلی٬
پروبهای نشاندار شده با بیوتین و digoxigenin
نیاز به یک یا چند مرحله حدواسط قبل از ردیابی پروب دارند و بطور غیر مستقیم
ردیابی می شوند. Digoxigenin  استروئیدی است که از شکوفه ها و برگهای گیاه digitalis
بدست می آید. آنتی بادیهای anti-digoxigenin با دیگر مواد بیولوژیکی واکنش نمی دهند. مزیت استفاده از digoxigeninآن
است که، می توان آن را با استفاده از آنتی بادیهای ملحق شده به تعدادی از برچسب ها
از قبیل آلکالین فسفاتاز ردیابی کرد. این آنزیم در حضور ماده زمینه NBT/BCIP
رسوب آبی رنگ و در حضور ماده زمینه HNPP رنگ فلورسنت
تولید می کند.  بیوتین می تواند به ATP
و دیگر نوکلئوتیدها متصل شود و با آنتی بادیها قابل رویت است ولی معمولا از یک
گلیکوپروتئین 65 کیلودالتونی بنام Avidin (از سفیده
تخم مرغ ) یا استرپتاویدین (از قارچ Streptomyces avidinii)
استفاده میشود که ظرفیت اتصال بالایی به بیوتین دارند.

برچسب digoxigenin
به مراتب حساستر از بیوتین است و میتوان حساسیت آن را با پروبهای نشاندار شده با 35S قیاس کرد.
میزان حساسیت پروبهای نشاندار شده با digoxigenin
یک دهم پیکوگرم در سادرن بلات و 10 برابر کمتراز آن در ISH
است(10٬6).

6-4: کنترل

آیا واکنش
تولید شده در هیبریداسیون مربوط به اتصال پروب به ترادف هدف است؟ اگر در
هیبریداسیون هیچ رنگی مشاهده نشد آیا واقعا ترادف مورد نظر در بافت وجود نداشته یا
ممکن است در تهیه بافت یا خود بافت مشکلی داشته باشیم.  برای اینکه بتوانیم به این سوال ها با قاطیت
جوا ب دهیم بایستی کنترل های زیر را بکار ببریم.

 

1-6-4: کنترل های کیفیت mRNA
بافت و کارایی پروتکل

در تشخیص mRNA
میتوان از پروب poly(dT) و همچنین از پروبهایی برای
تشخیص ژنهای ساختمانی مانند اکتین یا بتا توبولین استفاده کنیم که اگر سیگنال
ضعیفی در این روشها بدست آمد RNA بافت از بین رفته است. در
نهایت می توان از بافت تازه حاوی ترادف مورد نظر(کنترل مثبت) استفاده کرد اگر
سیگنالی ردیابی نشد در تکنیک مورد استفاده اشکالی وجود دارد.

2-6-4: کنترل های اختصاصیت پروب

برای تعیین اختصاصیت پروب بایستی قبل
ازهیبریداسیون با آن٬ بافت را با RNase  تیمار کنیم (کنترل منفی) عدم تولید سیگنال نشان
دهنده ی  این است که اتصال ترادف هدف به
پروب در دیگر نمونه ها بطور اختصاصی صورت گرفته است. روش دیگر اینست که بافت را با
هر دو پروب رشته ی  مثبت و منفی بطور موازی
هیبرید کنیم. بدلیل ماهیت شیمیایی پروب مثبت از لحاظ تئوری به هر رشته mRNA
 و
ترادف های دیگر بجز ترادف مورد نظر متصل می شود. اگر پروب مثبت چیزی تشخیص نداد می
توان مطمئن شد که هر سیگنالی که توسط پروب منفی تولید می شود اختصاصی است(10٬6٬2٬3).

اتصال اختصاصی قابل اشباع است یعنی
تعداد محدودی ملکول هدف وجود دارد که پروب می تواند به آنها وصل شود. از این  خاصیت در مطالعه ی مقایسه ای پروبهای نشاندار
نشده با غلظت بالا با پروبهای نشاندار شده استفاده می شود. پروب نشاندار نشده
اضافی در اثر رقابت برای اتصال به سایت ها جایگزین اتصال اختصاصی پروبهای نشاندار
شده شود اما جایگزین اتصال غیر اختصاصی پروبهای نشاندار شده نمی شود. بهتر است قبل
از هیبریداسون با پروب منفی نشاندار شده بافت را با غلظت 10 مولار پروب نشاندار
نشده و پروب منفی نشاندار نشده تیمار کنیم. پروب منفی ترجیحا بایستی محتوی GC
و طول یکسانی باشد و با ترادف مورد نظر همولوژی نداشته باشد. در نهایت بهترین راه
برای اطمینان از اتصال اختصاصی پروب به ترادف هدف٬
انتخاب ترادف صحیح پروب و انجام هیبریداسیون و شستشو تحت شرایط stringency
بالا است(2٬3٬10٬6).

بحث

ISH  روشی منحصربفرد و قوی برای ردیابی RNA
و DNA و مطالعه الگوی بیان ژنها در
داخل بافت ها و سلول ها می باشد ولی در تفسیر نتایج بایستی دقت شود و کنترل های
لازم بکار برده شود. در این روش می توان ارتباط بین الگوهای بیان و فنوتیپ های خاص
سلولی بررسی کرد. همچنین با استفاده از این روش می توان حرکت RNA
را درون سلولهای زنده مشاهده کرد. اینکار مدلهایی برای تعیین چگونگی و محل بیان ترادفهای
خاص و مراحل پردازش رونوشت ها و انتقال آنها از هسته را فراهم میکند(11).

روشهای تهیه
پروب با استفاده از PCR باعث کاهش
قابل ملاحضه ای در زمان مورد نیاز برای انجام ISH
میشوند. همچنین در مواردی که ترادف مورد نظر در بافت یا داخل سلول غلظت پایینی
داشته باشد می توان از ترکیب هیبریداسیون و PCR
در روشی بنام in situ PCR استفاده کرد(6٬10٬2٬3).

روشهای
غیررادیواکتیو در مقایسه با روشهای رادیواکتیو مزایای زیادی دارند از جمله نیاز به
مدت زمان کوتاهتر برای توسعه سیگنال٬ وضوح بالا٬
حساسیت تشخیص بالا٬ هزینه کم نشاندار کردن پروب٬ مدت
زمان نگهداری بالا و نداشتن خطربرای سلامتی انسان ومحیط زیست را میتوان نام برد(10٬6٬12).

 

 

منابع مورد
استفاده:

1- Anderson, M. L. M.
1999. Nucleic acid hybridization. BIOS Scientific Publisher Ltd. 240 P.

2- Schwarzacher, T. and
Heslop-Harrison, P. 2000. Practical in situ Hybridization. BIOS Scientific
Publisher Ltd. 203 P.

3- Levy, E. R. and
Herrington, C. S. 1995. Non-Isotopic methods in molecular biology. Oxford
university press. 221P.

4- Hames, B. D. and Higgins, S. J. 1995. Gene probes 2- A
Practical Approach. In situ hybridization of nucleic acid probes to cellular
RNA. Oxford university press. Pages: 183-209

5-Online: http://www.epibio.com/
.2007 . Non-radioactive In Situ Hybridization Using Digoxigenin-labeled RNA
Probes Generated with the AmpliScribe™ T7, SP6 and T3 High Yield Transcription
Kits. EPICENTRE Biotechnologies.

6- Online:  http://www.genedetect.com/. 2007. In situ
hybridization.

7- Online: http://www-biology.ucsd.edu/.2003.
Kosman, D. Multiplex Fluorescent mRNA In Situ Hybridization.

8.Online:http://www.nanoprobes.com/.2006.InSitu

Hybridization with Nanogold-Streptavidin.

9.Online:http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_in_situ_hybridization.
2007.06.08

10.Online:http://osiris.rutgers.edu/%7Esmm/academic.htm.Montgomery,S.M.2002.
In situ Hybridization

11- Levsky, J. M. and 
Singer, R. H. 2003. Fluorescence in situ hybridization: past, present
and future.  Journal of Cell Science 116,
2833-2838

12- Osborn, J. 2000. A review of radioactive and non-radioactive-
based techniques used in life science applications. Amersham Pharmacia Biotech.

13- Wang, D. and Maule, A. J. 1994. A Model for Seed Transmission
of a Plant Virus: Genetic and Structural Analyses of Pea Embryo lnvasion by Pea
Seed-Borne Mosaic Virus. The Plant Cell, Vol. 6, 777-787

14- Lima, M. I., Fonseca,
M. E. N., Flores, R. and Kitajima, E. W. Detection
of avocado sunblotch viroid in chloroplasts of avocado leaves by in situ
hybridization. Archives of
Virology
.Vol: 138,
Numbers 3-4
.Pages: 385-390