Assay در تشخیص معمول ویروس ها ، همیشه آزمایش تعداد زیادی نمونه ضرورت دارد .
تا قبل از ابداع و ارائه روش الیزا ، انجام چنین آزمایش هایی در تشخیص برخی از
ویروس ها غیر ممکن بوده و تنها با بکارگیری نیروی انسانی زیاد ، استفاده از تعداد
زیادی گیاه آزمون و امکانات گلخانه ای وسیع عملی بود . روش الیزا که در سال 1976
در ارتباط با تشخیص ویروس های گیاهی مطرح شده ، دارای مزایای زیر است :


.
حساسیت زیاد

2. کاربرد
مناسب در ارزیابی تعداد زیادی نمونه

3. اقتصادی
بودن آن در مصرف آنتی سرم های گران قیمت

4. حالات نیمه
خودکار یا خودکار بودن آن

5. مستقل بودن
از مورفولوژی

6. مستقل بودن
از غلظت ویروس

    استفاده از روش الیزا در تشخیص ویروس های
گیاهی به نحو گسترده ای مورد بررسی و تجدید نظر قرار گرفته و اصلاحات وتغییراتی
درآن وجود آمد است .

 (الیزای مستقیمی   Dired-Elisa)

از روش های
معمول الیزا ، روش موسوم به ساندویچ دو طرفه آنتی بادی(Doublcatibody\-sandwech

ELISAیا DAS-ELISA)
است که در آن ویروس بین دو لایه آنتی بادی قرار می گیرد . این تکنیک اغلب بارتشخیص
ویروس گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد . در بیشتر موارد آنزیم مصرفی ، آلکالین
فسفاتاز(Ap)
است . با انجام اصطلاحات و تغییراتی در روش معمول الیزا (DAS-ELISA) ،
روشهایی ارائه شده که در شناسایی ویروس های گیاهی مورد استفاده قرار می گیرند .
سیستم غیره مستقیم الیزا (Indirect-Elisa)
شبیه به روش مستقیم ساندویچ دو ظرفه می باشد ، با این تفاوت که لایه دوم آنتی بادی
اختصاصی تولید شده در خرگوش به آنزیم متصل نمی شود ، بلکه پیوند ضد آنتی بادی
خرگوش –آتزیم (Enzyme-anti-rabbit)در
مرحله بعد اضافه می شود.

در نمونه
سالم  تغییر رنگ ( رنگ زرد ) مشاهده  نمی شود ولی نمونه آلوده به رنگ زرد در  می آید .شدت رنگ زرد در ارزیابی نهایی با غلظت
ویروس متناسب است .نتیجه آزمون الیزا با استفاده از دستگاه ELISA Reader
خوانده می شود و در طول موج 40 نانومتر  یا
405 نانومتر پلیت الیزا از 12 ستون و 8 ردیف تشکیل شده است . در تمام آزمون های
سرولوژیکی از کنترل مثبت( آلوده ) و از کنترل منفی(گیاه سالم  ) استفاده می شود. 

 

مراحل کار

( گیاه مورد
آزمایش گیاه tabacum cv. Turkish Nicotiana آلوده به ویروس TMV)

  1. 3 گرم از بافت آلوده (سیستمیک) و بافت سالم را
    هر کدام در 3 میلی لیتر بافر نمونه می کوبیم و از پارچه صافی که قبلا خیس شده رد
    می کنیم و عصاره را در درون اپندورف می ریزیم.

 


  • روش تهیه بافر
    نمونه

بافر شستشو (روش تهیه این در پایین توضیح داده
شده) را به همراه 2 درصد از PVP  درست می کنیم. در اینجا ما 20 میلی لیتر بافر
شستو شو به همراه 4/0 گرم PVP که
به آرامی بروی استایرر اضافه کردیم.

  1. از هر کدام از آنها رقعت های 20/1 و 10/1  به اندازه 2 میلی لیترتهیه می کنیم.
  2. طبق جدول زیر( سمت راست جدول) عصاره ها و رقعت
    ها را در هر چاهک از پلیت به اندازه 100 میکرولیتر می ریزیم.

 

 

 

 

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

 


  
   
   
   
  
  
  
   
  
  
 
  
 
  
  
 
  
   
   

                   
     
     

رقت های IgG

     
     

   
 

 

2000/1

 

 

1500/1

 

 

1000/1

 

 

500/1


  
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
  
  
  
   
   
  
 

A


  
   
   

                   
     
     

I

     

H

     

I)
      
      
       
       
       
       
       
       
       
       
       
       
       
       
      
      
      
     
      
     
(

     

H)
      
     
(

     

I)
      
     
(

     

H)
      
     
(

     

 

     
     

   
 
  
   
   

                   
     
     

 

     
     

   
  B

 

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B


  
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
  
  
  
   
   
  
  -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

C

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

D

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

E

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

F

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

G

-

-

-

-

-

-

-

-

-


  
  
 
  
  -


  
  -

-


  
  H

 

 

                                 H گیاه سالم                                   5000/1      4000/1       3000/1

                               I گیاه
آلوده                                                     رقت
های آنتی ربیت

  1. پلیت را در درون سرد خانه به مدت یک شب نگهداری
    کردیم.
  2. پلیت را با استفاده از بافر شستو شو در سه
    مرحله و هر مرحله 3 دقیقه شستوشو دادیم، و سپس با تکان دادن و ضربه زدن بروی کاغذ
    پلیت را خشک کردیم.

  • روش تهیه بافر
    شستوشو

مقدار 100 میلی لیتر از بافر 10 PBS ×
ساخته شده را با 900 میلی لیتر آب مقطر مخلوط می کنیم ، تبدیل به PBS×1 می
شود و به این محلول 5/0 میلی لیتر tween20  اضافه می کنیم . با رساندن PH
محلول به 4/7 ، بافر شستشو آماده می شود.

  1. حال در داخل چاهک ها طبق نقشه الیزا بالا
    (بالای نقشه) رقعت های 500/1 ، 1000/1 ، 1500/1 و 2000/1 را از آنتی بادی به همراه
    بافر بلاکینگ  تهیه کرده و هرکدام 100
    میکرولیتر می ریزیم.

  • روش تهیه بافر
    بلانکینگ

بافر نمونه 
به همراه 3 درصد شیر خشک

  1. 4 ساعت در در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد
    نگهداری می شود.
  2. شستشو و خشک کردن پلیت مثل مرحله 5
  3. طبق نقشه الیزا (قسمت پایین) سه رقعت از آنتی
    ربیت را با رقعت های 3000/1 ، 4000/1 و 5000/1 با بافر بلاکینگ در هر چاهک 100
    میکرو لیتر می ریزیم.

10.به مدت 4 ساعت در دمایی 37 درجه سانتی گراد
نگهداری می کنیم.

11.شستوشو طبق مرحله 5

12.درون هر چاهک 100 میکرو لیتر بافر سوبسترا(بافر
همراه با رنگ) می ریزیم.


  • روش تهیه رنگ

18 میلی لیتر آب را با 2 میلی لیتر دی اتانول
آمین حل کرده و PH  آن را بوسیله HCl  به 8/9 می رسانیم. و سپس به ازای هر میلی لیتر
یک میلی گرم رنگ پارانیتروفنیل فسفات میریزیم.

در این مرحله
باید 10 تا 30 دقیقه صبر کنیم(در مواردی شاید بیشتر) تا چاهک ها رنگ بگیرند.