مراحل کار

چندین روش برای خالص سازی TMV  وجود دارد در این روش ما TMV را با استفاده از PEG خالص می کنیم.


. جمع آوری برگ های تورکیش آلوده شده به TMV و برای مدت چند ساعت در 20- قرار می دهیم

2. مقدار 40 گرم از بافت یخ زده را در بافر فسفات 05/0 مولار با PH=7/4  دارای 1/0 درصد مرکاپتواتانول را در یک مخلوط کن قرار می دهیم(4 میلی لیتر بافر برای هر گرم بافت) و به مدت حدود 5 دقیقه اجازه می دهیم خرد شود.

3. با استفاده از یک پارچه ململ تفاله را جدا کرده و دور می ریزیم

  1. در حدود 3 میلی لیتر از عصاره استخراج شده را برای سنجش بروی گلوتینوزا در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری می کنیم
  2. با استفاده از یک استوانه مدرج حجم عصاره را اندازه می گیریم که 170 میلی لیتر بود و سپس 3/9 میلی لیتر از ان- بوتانول را به ازای 100 میلی لیتر از عصاره به صورت قطره ای در زمانی که عصاره بروی همزن مغناطیسی در سردخانه است می ریزیم(81/15 میلی لیتر) و برای مدت 45 دقیقه شیک می شود.
  3. سانتریوفیوژ کردن به مدت 30 دقیقه با سرعت g10000 (9000rpm-ss34) در این مرحله ذرات گیاهی رسوب می کنند
  4. دور انداختن رسوب و نگهداری رونشین و اضافه کردن 4 گرم بر 100 میلی لیتر PEG 6000 به صورت تدریجی زمانی که بروی همزن مغناطیسی است اضافه می کنیم(68/6گرم)، همچنین برای رسوب دادن PEG یا باید مولاریته بافر بالا باشد یا با استفاده از نمک غلظت یونی را بالا ببریم، که ما در اینجا به ازای هر 100 میلی لیتر 4 گرم NaCL به همراه PEG  اضافه کردیم(68/6گرم) حدودا 2 ساعت بروی همزن در سرد خانه می ماند.
  5. سانتریفیوژ برای برای 30 دقیقه با سرعت 10000G(9000rpm)
  6. حذف رو نشین و رسوب به دست امده را در 5/1 حجم بافر مورد استفاده در مرحله اول (در 34 میلی لیتر) را حل می کنیم.

10.15 دقبقه سانتریفیوژ با سرعت 10000g (در این مرحله چون غلظت یونی پایین است PEG به تنهایی رسوب می کند.)

11.حذف رسوب و رونشین حاوی ویروس خالص است

12.در این مرحله نیز به ازای 100 میلی لیتر 4 گرم PEG و NaCl اضافه می کنیم(32/1 گرم PEG ش و 32/1  گرم NaCl)

13.سانتریفیوژ کردن به مدت 15 دقیقه با g10000 و رونشین را حذف و رسوب را نگه می داریم

14.رسوب را در 50/1 حجم اولیه بافر حل می کنیم (4/3 میلی لیتر)

15.سانتریفیوژ کردن به مدت 5 دقیقه با g10000   و در اینجا PEG رسوب می کند و رونشین ویروس ماست.