الکتروفورز (Electrophoresis) به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند.

به سبب اینکه ماکرومولکول‌های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین‌ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. روش‌های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول‌ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌ها ابداع شده‌است.

 


الکتروفورز ژل

از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌شود. به منظور بررسی پروتئین‌ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئین‌ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین‌ها شده و به آنها متصل می‌شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول‌های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید.

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می‌شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌شود. قدرت تفکیک ژل‌های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳٪ و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸/۰ ٪ استفاده می‌شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل‌ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب‌های اسیدهای نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول‌ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل‌ها مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود.

مراحل کار

ابتدا سینی و شانه را متناسب با کار انتخاب می کنیم،دور سینی را با چسب می بندیم تا موقع ریختن آگارز، آگارز نریزد، به شکلی که نصف بیشتر چسب بالای لبه سینی و بقیه در زیر سینی آن را محکم بگیرد تا دو طرف باز سینی را مسدود کنیم.

سپس یک قطعه شیشه ای مخصوص که هم اندازه سینی است و درون آن قرار می گیرد به شکلی که دو طرف این قطعه بر سینی سوار باشد.و ما باید شانه را با یک نگهدارنده به این قطعه وصل کنیم  طوری که فاصله نوک شانه تا کف سینی به اندازه یک برگ کاغذ رعایت شده باشد. باید فاصله لبه های شانه تا لبه های سینی در دو طرف مساوی باشد، تا باند های ما در یک سطر قرار بگیرند.

ژل ما معمولا آگارز یک درصد است، و بافر TBA ، که مقدار استفاده شده در هرکدام از سینی ها متفاوت است(بستگی به اندازه سینی دارد) برای سینی که ما استفاده کردیم 70 سی سی بافر با 7/0 گرم  آگارز آماده کردیم.

بعد از ریختن آگارز و بافر در بتری مخصوص آن را در میکرو ویو قرار می دهیم تا خوب حل شود (به مدت 5-4 دقیقه) سپس ژل را بیرون آورده و آن را در زیر آب سرد می کنیم، تا دما آن به حدی برسد که دست را نسوزاند(50-40 درجه سانتی گراد)،سپس به آرمی ژل را در سینی می ریزیم و اجازه می دهیم که ژل ببندد.

در این فاصله زمانی ما رنگ اتیدیوم بروماید را با نمونه مورد نظر ترکیب می کنیم به روشی که ابتدا چند قطره رنگ را روی یک صفحه پلاستیکی ریخته و بعد محصول PCR را به ان با استفاده از یک میکروپیپت به رنگها اضافه می کنیم، ودر یکی از رنگها مارکری را نیز می ریزیم.

حال دیگر ژل ما بسته و شانه را به آرامی بر می داریم و چسب ها را از اطراف آن جدا می کنیم و سینی را در داخل تانک مخصوص خودش می گذاریم. و سپس در سطح آن بافر می ریزیم(همان بافری که آگارز را در آن حل کردیم) و سپس نمونه ها را به آرامی توسط میکروپیپت در داخل چاهک ها قرار می دهیم، مارکر را نیز در یک چاهک می ریزیم.

حال دیگر زمان روشن کردن دستگاه است، که ولتاژ آن معمولا 100-80 است، و نمونه به آرامی شروع به حرکت می کند. مدت زمان کار دستگاه متفاوت است معمولا 40-30 دقیقه است.

بعداز این قطعات از هم جدا شده اند که ما می توانیم با استفاده از دستگاه ترانس لمیناتور از نمونه عکس برداری می کنیم.