تهیه اسلاید دائمی از بافت گیاهی و برسی کردن تغییرات در گیاه و سلول گیاهی را میکروتکنیک گویند. که ما در اینجا سعی می کنیم تغییرات بافت گیاه در مقابل عوامل بیماری زا را مورد بررسی قرار دهیم، مثلا برگ بادام آلوده به بیماری لکه آجری بادام چه تغییری در بافت آن صورت می گیرد، یا در گیاه آلوده به قارچ، قارچ چطور پیشروی می کند و گیاه چه عکس العملی انجام می دهد یک اسلاید خوب ارتباط بافت شناسی میزبان و پاتوژن را به خوبی نشان می‌دهد.


آناتومی شامل: الف. هیستولوژی(Hystologial)؛ در اینجا کار ما با بافت گیاه است ب. سیتولوژی(Cytologial)؛ کار ما با اندامکهای داخل سلولی است.

بنابراین روش های را کا ما برای هیستولوژی بکار می بریم با برای سیتولوزی مناسب نمی باشد، پس اول باید مطالعه کنیم که بافتی که داریم برای آن چکار کنیم. سلول با بافت خیلی فرق می کند، در سلول اندامک ها وجود دارند که وقتی پاتوژن در سلول رفت چه تغییراتی ایجاد می شود، سیتولوژی خیلی ظریف است و احتیاج به امکانات زیادی دارد و مراحل کار بسیار غلط انداز است و در هر اشتباه اندام ها از بین می روند.

 برای اطمینان از آسیب نزدن به بافت بایستی در تمام مراحل دقت لازم را به عمل آورد چون ساختارهای غیر نرمال نباید از نظر علائم هیستولوژیکی بیماری تفسیر شوند. اجتناب از پژمردگی مواد گیاهی یا بازگرداندن شادابی آن‌ها در یک محفظه‌ی مرطوب البته با جلوگیری از رشد ثانویه دیگر موجودات ضروری است. جهت بررسی پاتولوژیکی همیشه باید بافت‌های نرمال و عاری از بیماری و هم سن با نمونه‌های بیمار جمع آوری کرد. فرد باید مقداری علم آناتومی داشته باشد تا بتواند پاتولوژی کار کند.

 تهیه یک اسلاید دائمی با استفاده از مقطع گیری با میکروتوم اصولاً شامل مراحل زیر است:

1) جمع آوری نمونه و تکه تکه کردن آن

2) کشتن(killing) و تثبیت(Fixing) محتویات سلول‌ها و ساختارهای سلولی

3) آبگیری کردن (DEHYDRATION)

4) قالب گیری در پارافین(Boating) و آرایش کردن قالب(Terming)

5) برش دادن و تهیه نمونه باریک(Sectioning)

6) رنگ آمیزی مقاطع(Stainig) و قرار دادن آن‌ها در محیط نگهداری (MOUNTING FLUID)

قطعات برگ‌ها نباید ابعادی بیش از 5 میلی مترداشته باشند. ساقه‌های سبز با قطر بیشتر هم غالباً به صورت دیسک‌های 5 میل متربرش داده می‌شوند و شاخه‌های چوبی با قطر بیش از 5میلی متر باید به قطعات به طول 15 میلی مترتقسیم شوند ولی قطعات شاخه های بزرگتر باید به قطعات کوچکتر بریده شوند. چون ممکن است نفوذ مواد از طریق چوب پنبه مشکل باشد.

محلولی که ما برای کشندن و تثبیت کردن استفاده می کنیم محلول F.F.A به فرمول زیر است:

ماده

مقدار

اثر

اتیل الکل 70-60درصد

90 سی سی

باعث چروکیدگی بافت می شود

استیک اسید

5 سی سی

باعث تورم بافت و حفظ حالت بافت می شود

فرمالدهید 40-37 درصد

5 سی سی

باعث چروکیدگی بافت می شود

الکل باعث رسوب پروتئین ها و نکلوتید اسیدها می شود و باعث تجزیه چربی ها و لیپیدها می شود. در بافت های چوبی معمولا مقدار فرمالدهید را بیشتر از استیک اسید می ریزند. مقدار اینها در کارهای مختلف متفاوت است و بستگی به تکنیک کار ما دارد.

رنگ آمیزی برای افزایش کنتراست تصویری است که از بافت‌های پاتوژن و گیاه دیده خواهند شد. برخی از رنگ‌های عمومی پاتولوژی به این شرح‌اند:

رنگ

اندام رنگ کننده

ویژگی رنگ

سافرانین

هسته

جزه گروه Azo daye، دارای بار مثبت

Acid orang G

پروتوپلاسم، زمینه را طلایی می کند

جزه گروه Azo day، دارای خاصیت اسیدی و بار منفی

Basic Fushin

اسپور و میسلیوم

جزه گروهQuinanic ، دارای خاصیت بازی و بار مثبت

Fast Green

سیتوپلاسم گیاهی

-

Trypan Blue

ریسه

جزه گروه Azo daye،

Cotton Blue

اسپورها و میسلیوم ها

-

مراحل کار

نمونه برداری

 برگ‌های دارای سپتوریا کرفس و لکه آجری بادام جمع آوری گردید، و به یخچال انتقال داده شد. در آزمایشگاه با اسکالپل بر روی دستمال کاغذی مرطوب برگ‌ها به قطعات تقریبی 5 میلی متر طول و عرض بریده شدند و سپس در F.A.A ریخته شد، و پس از اتصال به پمپ خلاء هواگیری شد. نمونه‌ها پس از هواگیری در کف ظرف محتوی F.A.A که در حال هواگیری بود ته نشین شده بودند.

آب گیری

EOH (abs)

Absolate N.butyl Alchol

شماره بطری

CC 45

CC 30

CC 25

3

CC 30

CC30

CC 40

4

CC 20

CC 25

CC55

5

CC 10

CC 20

CC 70

6

CC0

CC 15

CC 85

7

CC 0

CC 0

CC 100

8

 

به وسیله پنس نمونه از شیشه به داخل شیشه جدید که در آن محلول شماره3 ریخته ایم قرار دادیم (سری بطری‌ها در جدول بالا آمده است) و به ظرف محتوی نمونه‌ها اضافه گردید. پس از یک ساعت مانند حالت قبلی سری شماره 3 با  پنس نمونه را به شیشه شماره چهار انتقال دادیم تا مرحله شماره 7 می توان از یک شیشه استفاده کرد ولی در مرحله7و8 باید از شیشه های جداگانه استفاده کرد تا مرحله 8 هریک ساعت تغییر می دهیم ولی مرحله8 خود شامل 3 مرحله که دوتا نیم ساعتی و یک مرحله آخر یک ساعتی می باشد.

 

Embeding

 برای آب گیری از N.butyl Alchol که هم حلال پارافین و هم –N بوتانول است استفاده شد. مرحله‌ی پارافین 3 مرحله‌ی یک ساعتی تقسیم شده است که در طی این سه مرحله پارافیین جایگزین بوتانول می شود. هر مرحله یک ساعت به طول می انجامد که باید نمونه ها را خیلی سریع به پارافین جدید انتقال دهیم قبل از اینکه پارافین ببندد و آن را به اون 70 درجه سانتی گراد انتقال دهیم سپس مرحله سوم به مدت یک شب در آون می ماند.

Boating

در این مرحله ما  با استفاده از فویل آلمینیوم قالب هایی به ابعاد cm 1×5/2×4 درست کردیم،. قوطی را روی hot plate قرار داده تا گرم بماند وپارافین مایع از درون آون پارافین خارجی و درون قوطی ریختم.  سپس قوطی تا نیمه درون مخلوط آب- یخ و یخ الکل بردیم یخ الکل باعث می شود دما سریع کاهش پیدا کند و پارافین ما ببندد و رگه ای نشود و با سوزن که روی شعله چراغ الکلی داغ شده بود قطعات بافت گیاهی موجود درون پارافین را منظم و خوب به صورت افقی در بت ما قرار گیرد. پس از انجماد پارافین ورق آلومینیومی اطراف بلوک جدا کردیم.

TRIMMING

در این مرحله ما باید بلوک خود را برروی تخته های مخصوصی که آماده شده است قرار دهیم که برای این کار ابتدا تخته را با استفاده از شعله گرم می کنیم و بلوک را به شکلی که نمونه ما در آن به صورت عمودی باشد روی تخته قرار می دهیم و اطراف بلوک را با چیپس ها خوب به تخته می چسبانیم تا در زمان مقطع گیری نیافتد، سپس با استفاده از اسکاپل داغ اطراف بلوک را آرایش و مرتب می کنیم تا آماده مرحله بعدی باشد.

مقطع گیری

 با استفاده از دستگاه میکروتوم خود دارای تنظیماتی است برش را انجام می دهیم. ضخامت نمونه را با استفاده از پیچ بغل روی 18 میلی متر تنظیم کردیم تیغ را باید طوری تنظیم کنیم که مقاطع را به صورت نوار در بیاورد البته باید قبل از همه اینها پیچ داخل دستگاه که مربوط به جلو آمدن گیره تخته است را تنظیم کنیم. با کمک دستگاه ما توانستیم نمونه های خوبی به شکل نواری تهیه کنیم.

تثبیت نمونه روی لام

از یک لام تمییز و سالم برای کار استفاده می کنیم و در صورت لازم با الکل شستو شو می دهیم، لام‌ها پس از تمیز شدن با الکل به روی WARM TABLE  با دمای 40درجه قرار می دهیم.یک قطره از چسب haupts adhesive (ساخته شده از یک گرم ژلاتین در 100سی سی آب و افزودن 2 گرم فنول کریستال و 15 سی سی گلیسرین و در نهایت 10 میلی لیتر فرمالدهید 40-37 درصد) روی سطح لام می ریزیم و با آرامی آن را پهن می کنیم، سپس نوار را طوری روی لام قرار می دهیم که به خوبی پهن شود و تا نخورد سپس آن را به مدت سه روز روی WARM TABLE  قرار دایم.

حذف پارافین و رنگ آمیزی

 در روز سوم نمونه را برای حذف پارافین و رنگ آمیزی در یک سری محلولها طبق جدول زیر قرار می دهیم:

ردیف

محلول

زمان ماندگاری در محلول

1

زایلین 100 درصد

5 دقیقه

2

الکل اتیلیک 100 درصد

5 دقیقه

3

الکل اتیلیک 95 درصد

5 دقیقه

4

الکل اتیلیک 70 درصد

5 دقیقه

5

الکل اتیلیک 50 درصد

5 دقیقه

6

محلول سافرانین-o

24-18 ساعت

7

الکل اتیلیک 50 درصد

5 دقیقه

8

رنگ Fast Green

10-5 ثانیه

9

الکل اتیلیک 95 درصد

5 دقیقه

10

الکل اتیلیک 100 درصد

5 دقیقه

11

زایلین 100 درصد

5 دقیقه

 بعد از این مراحل برای جلوگیری از هدر رفتن رطوبت و تثبیت لامل یک قطره از چسب Canada Balsam را روی لام ریخته و لامل را روی شعله گرم می کنیم و به آرامی روی لام می گذاریم به شکلی که هوا نگیرد سپس اطراف لامل را با زایلین تمییز کردیم وبه اسلاید مدتی اجازه دادیم تا خشک شود.